2020年初，一場突如其來的傳染病大流行給全世界帶來了巨大變數，隨后國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組（Coronavirus study group）正式命名新型冠狀病毒（2019-nCoV）為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），這表明新型冠狀病毒從分類學角度講，是SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的近親，與2003年“非典”的罪魁禍首SARS病毒部分結構相似，但新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）具有更強的傳染能力和應對溫度變化的能力，并且可在復制過程中不斷適應宿主而產生突變。在此情況下，人類把終結這一疫情大流行的希望寄托于疫苗的成功研發，各國醫療機構、企業紛紛投入疫苗的研制中。
從技術路線上看，新冠疫苗的種類包括滅活疫苗、重組蛋白疫苗、載體疫苗（包括腺病毒載體、減毒流感病毒載體）、核酸疫苗（mRNA疫苗、DNA疫苗）。如圖1所示，目前，國內已上市7款新冠疫苗產品，所屬單位分別是北京生物、武漢生物、科興中維、康希諾、智飛生物、康泰生物及中國醫學科學院醫學生物學研究所（以下簡稱：醫科院生物所），技術路線集中在滅活、重組蛋白及腺病毒載體疫苗。上述企業針對各自在國內上市的新冠疫苗均布局了相關專利（如圖1所示），但布局側重點不同。其中，北京生物、武漢生物、醫科院生物所采用的技術路線為滅活疫苗，康希諾生物采用的技術路線為腺病毒載體疫苗，智飛生物采用的技術路線為重組蛋白疫苗，上述企業均布局了疫苗制備方法相關核心專利（CN111662881B、CN111569058B、CN112546213A、CN111218459B、CN113584106B）。而同樣采用滅活疫苗技術路線的康泰生物，其全資子公司北京民海生物科技有限公司和科興中維則從疫苗中結構蛋白含量檢測及滅活疫苗組合物方面布局了相關專利（CN112225782B、CN113521274A）。接下來筆者將結合相關專利信息對國內已上市新冠疫苗涉及到的三種技術路線：滅活疫苗、腺病毒載體疫苗、重組蛋白疫苗，以及國內未來新冠疫苗相關技術的研發熱點mRNA疫苗作詳細介紹。滅活疫苗的原理很簡單，就是把經過滅活的病毒，作為抗原，制成疫苗制劑。滅活疫苗保留了抗原的免疫原性，當注射到機體體內后，滅活的病毒顆粒作為抗原物質，刺激機體產生抗體，從而使機體具有抵御該種(型)病毒的能力。目前國內已上市的七款新冠疫苗中，有五款為滅活疫苗，其中包括北京生物、武漢生物、科興中維等。我們從專利中可以大致看出滅活疫苗的生產工藝。以北京生物為例，其在專利CN111662881B中公開了一種新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細胞滅活疫苗病毒液的生產方法，包括在裝填有片狀載體的籃式生物反應器中加入細胞生長液，接種Vero細胞進行培養，至長成致密單層后，采用細胞維持液洗換；洗換結束后注入細胞維持液，進行新型冠狀病毒的接種，病毒接種的MOI為0.005～0.4，病毒培養溫度為36±1℃，溶氧≥40％，控制病毒培養階段體系pH值為7.2～7.6；病毒接種后培養48～96h，收獲病毒液。該方法應用籃式反應器成功培養獲得了新型冠狀病毒Vero細胞滅活疫苗病毒液，細胞接種密度大，病毒滴度高，批間差異高度可控且質量均一。其另一篇相關專利CN111575249B公開了一種新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細胞滅活疫苗病毒液的純化方法，包括將滅活的新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細胞病毒液通過濾膜初步過濾，然后通過濾膜超濾濃縮得到新型冠狀病毒濃縮液后加入核酸酶，降解Vero細胞中殘留的DNA，之后將復合填料Capto Core 700裝入層析柱中，先采用堿液沖洗，再用洗脫液平衡2～5個柱體積，接著將病毒濃縮液泵入到層析柱中，洗脫液洗脫；在紫外檢測波長280nm條件下，收集第一個流穿峰即為病毒純化液。該方法采用超濾濃縮、核酸酶消化和柱層析工藝步驟，結合復合填料Capto Core 700對新型冠狀病毒液進行純化，能夠快速、穩定地大規模生產新型冠狀病毒Vero細胞滅活疫苗病毒純化液。從北京生物相關專利公開的內容可以發現，新冠滅活疫苗生產工藝大致為應用籃式生物反應器制備新型冠狀病毒滅活疫苗(Vero細胞)病毒液，經過病毒培養、滅活、純化，后經適當稀釋后配制新型冠狀病毒滅活疫苗，配制后分裝，得到新型冠狀病毒Vero細胞滅活疫苗制品。腺病毒載體技術簡單來說就是把腺病毒中原有與復制相關的基因剔除，替換為新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的基因。這樣做的目的是使重新組裝的病毒復制新冠病毒刺突蛋白，從而刺激我們的免疫系統啟動免疫應答，產生免疫記憶。目前國內上市的腺病毒載體新冠疫苗是由軍事科學院軍事醫學研究院陳薇院士團隊及康希諾生物聯合研發的。康希諾相關專利CN111218459B中公開了制備重組腺病毒的方法：以E1、E3聯合缺失的復制缺陷型人5型腺病毒為載體，以整合腺病毒E1基因的HEK293細胞為包裝細胞系，攜帶的保護性抗原基因是經過優化設計的2019新型冠狀病毒(SARS?CoV?2)S蛋白基因(Ad5?nCoV)，通過構建穿梭質粒載體、轉染入宿主細胞、培養宿主細胞、收獲宿主細胞中釋放的人復制缺陷重組腺病毒、對重組腺病毒進行擴大培養、純化等步驟來制備所需的重組腺病毒。該方法中S蛋白基因經優化后，在轉染細胞中的表達水平顯著升高，且疫苗制備快速簡便，可在短期內實現大規模生產用于應對突發疫情。此外值得一提的是，10月26日，由康希諾研制的全球首款吸入用重組新型冠狀病毒疫苗(5型腺病毒載體)(簡稱“吸入式新冠疫苗”)在上海正式開始免費接種，這款疫苗與其此前已經獲得附條件上市批準的注射用新冠疫苗“克威莎”同屬一款疫苗，在肌注型腺病毒載體新冠疫苗“克威莎”的基礎上創新給藥方式，用霧化器將疫苗霧化成微小顆粒，通過口腔吸入的方式完成接種。對于吸入式新冠疫苗，康希諾在專利方面“早有準備”，早在2020年8月24日康希諾就申請了給藥方式為黏膜給藥的SARS-CoV-2重組腺病毒載體疫苗相關專利（CN113750227A）并申請了PCT國際專利，隨后更是布局了多件霧化裝置相關專利（詳見圖3）。中國科學院微生物研究所與安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司聯合研發的重組蛋白新冠疫苗是我國首個獲批的重組新冠病毒蛋白疫苗，是將新冠病毒最重要的抗原部分，放到一個工程細胞系里面來生產，然后將它生產出的抗原蛋白經過純化，再與佐劑進行混合，最后接種到人體內。關于其生產工藝，智飛生物在專利CN113584106B中公開了一種CHO細胞表達的重組新型冠狀病毒NCP-RBD蛋白的制備方法，包括取工作細胞株（表達重組新型冠狀病毒NCP?RBD蛋白的重組CHO細胞株）進行復蘇培養，得到細胞復蘇培養物后將細胞復蘇培養物進行擴增，得到細胞擴增培養物，之后將細胞擴增培養物進行罐培養，得到細胞收獲液，最后將細胞收獲液進行純化，得到所需產物。該方法可以將CHO細胞表達的重組新型冠狀病毒NCP?RBD蛋白高效的分離和純化，適用于規模化生產，同時能有效地用于生產新冠疫苗。智飛生物關于重組蛋白新冠疫苗的制備方法，將最有效的抗原成份通過基因工程的方法，在體外細胞中表達，通過類似于工業發酵的方式（即生物反應器）來生產蛋白，經過純化后制成疫苗，整個生產過程僅涉及蛋白表達和純化，沒有活病毒，因此生產過程安全性好，容易大規模生產。根據相關研究，目前滅活疫苗無法有效應對病毒突變，而mRNA疫苗在刺激細胞免疫方面具有一定優勢，此外mRNA疫苗產業化容易、速度快、成本低，從基因測序至生產只需要數周的時間，因此在對時間要求比較緊急的疫情中有望發揮重要作用。此外，mRNA技術在理論上可以生產出任何一種人類所需的蛋白質，在傳染性疾病以外的領域應用前景也非常廣闊，由此可見，mRNA技術的價值是不言而喻的，是未來各國相關企業的研發重點。雖然目前國內尚無mRNA 新冠疫苗獲批，但在新冠mRNA疫苗賽道上，超10家藥企已有相關產品研發和專利布局，例如沃森生物、艾博生物、斯微生物、艾美疫苗、深信生物、威斯津生物、康希諾、石藥集團、藍鵲生物、復星醫藥等。然而，mRNA技術存在兩大關鍵技術難點：序列設計和遞送系統，其中mRNA序列結構決定抗原蛋白結構、免疫原性及穩定性，優秀的序列設計可以更高效地表達抗原蛋白，最終提高mRNA疫苗激活特異免疫的精確性和活性。而遞送系統是目前產能擴張的瓶頸，也是目前mRNA疫苗的主要研發壁壘。由于mRNA很難通過細胞膜表面的脂質雙分子膜層以及mRNA具有的高天然免疫原性，其在體內傳遞效率低下，難以高效率地發揮作用，因此要實現mRNA疫苗的廣泛應用，高效的遞送系統是關鍵。在遞送系統方面，主流方法是采用LNP（脂質納米粒）技術遞送，LNP將mRNA包載其中，保護mRNA免于遞送過程的酶降解和免疫系統的清除，提高mRNA體內穩定性，促進其跨膜轉運且在細胞質中釋放mRNA用于翻譯蛋白，蛋白刺激機體產生免疫反應從而實現機體免疫。目前，國際公認的mRNA巨頭公司分別是Moderna、BioNTech和CureVac。但LNP技術的專利卻并不屬于這三家公司，LNP技術專利最開始由加拿大生物藥企Arbutus所掌握，曾授權給Moderna、CureVac和BioNtech。后來Moderna選擇自主研發，只不過Moderna在與Arbutus的LNP專利糾紛中敗訴，而BioNTech及CureVac在mRNA疫苗中使用的LNP載體，則明確是來自Arbutus的專利授權。針對LNP遞送技術，Arbutus申請了多項針對性的保護專利，其LNP遞送系統的核心專利US8058069B2（中國同族專利為CN102119217B）保護范圍包含核酸、陽離子脂質、非陽離子脂質、綴合脂質以及各成分的比例，對LNP組合物的組份及其配比進行了非常全面的保護，在2029年專利到期之前難以撼動。
圖4 Arbutus的LNP遞送系統核心專利
由于LNP的專利難以突破，如果企業不想通過授權使用，只能從發起專利挑戰或規避設計方面做文章，規避設計如采用區別于專利中陽離子脂質體的脂質或通過改變各組分配比實現優化，以尋求繞過現有專利的可能。目前，許多國內相關企業也想突破國外企業的專利壁壘，采用改進的LNP，并且已經開始布局相關專利，其中深信生物于2020年8月申請了相關專利“一種脂質納米顆粒”（CN114073677A），艾博生物于2021年8月申請了相關專利“脂質化合物和脂質納米顆粒組合物”（CN114391008A），康希諾與鍵凱科技于2022年1月申請了相關專利“一種用于核酸遞送的新型可電離脂質及其LNP組合物”（CN114149337B）并獲得授權。這種方法理論上可行，但真正能投入使用可能還需要一定時間。此外值得一提的是，與現階段大部分企業都采用的LNP遞送系統不同，斯微生物采用LPP遞送系統，由其聯合創始人沈海法研發，巧妙地繞開了LNP結構專利，并于2017年獲得美國休斯頓衛理公會醫院LPP遞送平臺全球獨家商業化授權。據斯微生物官網介紹，LPP (lipopolyplex) 納米遞送平臺是一種以聚合物包載mRNA為內核、磷脂包裹為外殼的雙層結構，LPP的雙層納米粒和傳統的LNP相比具有更好的包載、保護mRNA的效果，并能夠隨聚合物的降解逐步釋放mRNA分子，LPP平臺優異的樹突狀細胞靶向性可以更好地通過抗原遞呈激活T細胞的免疫反應，從而達到理想的免疫治療效果。綜合來看，國內相關企業已具備專利預警和避開專利壁壘的前期意識，同時正憑借自身研發能力布局具有自主知識產權的關鍵專利技術，國產新冠疫苗競爭力進一步加強，在未來新冠疫苗領域的全球競爭中，中國企業有望占據更有利的地位。作者：朱江月 品源知識產權代理
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